cGAMP@vEVs被肿瘤细胞

和树突状细胞的靶向摄取

如图2a所示，与其他细胞系相比，同型4T1细胞在2小时孵育后显示出更多的cGAMP@vEVs（用4T1细胞的vEVs加载cGAMP）。定量分析表明cGAMP@vEVs处理的4T1细胞的平均荧光强度（MFI）大约是cGAMP@vEVs处理的HepG2（人肝细胞癌）、B16（小鼠黑色素瘤）、CT26（小鼠结肠癌）或HC11（小鼠正常乳腺）细胞的3-10倍。如图2c所示，与cGAMP@tEVs相比BMDCs显示出更多的cGAMP@vEVs。cGAMP@vEVs阳性BMDCs的百分比大约是cGAMP@tEVs阳性BMDCs的1.38倍，表明vEVs上的CRT显著增强了BMDCs对cGAMP的摄取效率。

图2

STING通路激活与

肿瘤相关抗原交叉呈递

共聚焦成像和共定位效率分析表明大多数tEV递送的Cy5-cGAMP在与BMDCs共孵育6小时后与内质网和溶酶体共定位，而大多数vEV递送的Cy5-cGAMP分散在细胞质中。与单独用cGAMP或cGAMP@tEVs处理的BMDCs相比，用cGAMP@vEVs处理的BMDCs显示出显著增强的磷酸化IRF3和TBK1的表达。与cGAMP或cGAMP@tEV处理的BMDCs相比cGAMP@vEVs处理的BMDCs产生了最高水平的IFN-β（51.51±3.12 pg/mL），而cGAMP或cGAMP@tEV处理的BMDCs仅诱导了低或中等水平的IFN-β（分别为24.14±1.05和35.70±1.60 pg/mL）。此外，cGAMP@vEV处理导致同源肿瘤细胞中磷酸化IRF3和TBK1的表达增强。

如图3k-n所示，与cGAMP处理的BMDCs相比，cGAMP@vEVs处理的BMDCs中MHC-I和CD80CD86的表达水平显著上调，分别为1.94倍和1.62倍；与cGAMP@tEVs处理的BMDCs相比，分别为1.23倍和1.29倍，表明DC成熟。此外，cGAMP@vEVs诱导BMDCs产生最高水平的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）。在cGAMP@vEVs处理后观察到CD3⁺ CD8⁺ T细胞群中CD69⁺ T细胞的百分比增加，伴随着IFN-γ和颗粒酶B的产生增加，表明T细胞激活效率高。

图3

体内肿瘤-淋巴结双靶向与免疫激活

DiR信号逐渐在肿瘤和LNs中积累，并在注射后48小时达到峰值；然而在正常组织中几乎检测不到。DiR标记的cGAMP@vEVs的峰值强度在肿瘤中与DiR标记的tEVs相当，而在LNs中大约是后者的两倍。大量cGAMP@vEVs在LNs中积累并与DCs共定位，证实cGAMP@vEVs能够有效地迁移到LNs并与DCs在体内特异性相互作用。

此外，与cGAMP@tEVs处理的小鼠相比cGAMP@vEVs处理的小鼠的LNs中包含更多的免疫细胞，这些共定位的DCs与CD4⁺和CD8⁺ T细胞高度共定位（共定位效率分别为99.6%和98.9%），表明潜在的T细胞激活。cGAMP@vEVs处理的小鼠的腹股沟LNs中DCs的CD80 CD86和MHC-II的表达水平最高，从12.1%和12.3%分别增加到40%和37.2%。与单独用cGAMP或cGAMP@tEVs处理的小鼠相比，cGAMP@vEVs处理的小鼠中DCs的MHC-I表达水平分别增加了1.59倍和1.14倍。此外，cGAMP@vEVs处理导致引流LNs中CD11c⁺SIINFEKL-H-2Kb⁺抗原交叉呈递DCs的最大水平。

图4

肿瘤微环境调控与肿瘤进展抑制

与调节性T细胞（Tregs，CD25⁺Foxp3⁺）相比，CD4⁺（CD4⁺CD3⁺）和CD8⁺（CD8⁺CD3⁺）T细胞的百分比显著增加。cGAMP@vEVs注射导致肿瘤内CD8⁺和CD4⁺ T细胞与Tregs的比例分别增加了8.69倍和14.4倍。此外，cGAMP@vEV处理显著增加了肿瘤内CTLs（CD3⁺CD8⁺IFNγ⁺）的丰度。如图5h所示，与PBS组相比，用vEVs处理的肿瘤显示出许多免疫激活相关基因的上调表达，如CXCL10、CD40和TLR9，以及免疫抑制基因的下调表达，如MMP10和VEGFA。癌症促进因子如TGFB2和ARG1也被下调。

与PBS组相比，vEV处理组的细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路和趋化因子信号通路显著激活。与单独用cGAMP、cGAMP ⁺ vEVs或cGAMP@tEVs处理的组相比，cGAMP@vEVs组显示出更明显的肿瘤生长抑制。此外，其他组的小鼠在45天内死亡；然而，>83%的cGAMP@vEVs组小鼠存活。

图5

抑制肿瘤转移和复发

如图6b所示，在用PBS、tEVs、vEVs、cGAMP或cGAMP@tEVs处理的小鼠中观察到明显的肺转移，而在用cGAMP@vEV处理的组中几乎未观察到转移。此外，cGAMP@vEV处理组的肺转移瘤数量和肺重量显著减少（图6c-d），突显了cGAMP@vEVs在抑制肿瘤转移方面的显著优势。

cGAMP@vEVs处理组显示出显著的肿瘤生长抑制和更长的存活时间，肿瘤抑制率为50.6%（图6f-h）。定量分析显示，cGAMP@vEVs处理组小鼠脾脏中肿瘤特异性CD8⁺ T细胞的百分比显著增加（图6i）。此外，与PBS对照组相比，cGAMP@vEVs处理组小鼠脾脏中的效应记忆T细胞（TEM）（CD3⁺CD8⁺CD62L-CD44⁺细胞）增加了27.9%（图6j-k）。

图6

结论

该研究创新性地利用水疱性口炎病毒（VSV）感染的工程化肿瘤细胞来源的胞外囊泡（vEVs），构建了一种仿病毒纳米疫苗cGAMP@vEVs。该疫苗通过VSV-G糖蛋白和钙网蛋白（CRT）的协同作用，实现了淋巴结与肿瘤组织的双重靶向：一方面激活淋巴结中的STING通路以促进T细胞活化与增殖，另一方面直接作用于肿瘤微环境以逆转免疫抑制状态。与传统疫苗相比，该策略突破性地实现了多肿瘤抗原与佐剂cGAMP的共递送，克服了单一抗原免疫原性不足的缺陷，在显著提升疫苗生物利用度的同时确保了良好的安全性特征。

从临床转化角度来看，该技术方案具有显著的实用优势。可快速制备个性化疫苗，其工艺流程相较于新抗原疫苗或过继性细胞治疗更为简便可靠，为肿瘤免疫治疗的临床推广提供了新的技术路径。然而，要实现该疗法的临床应用，仍需通过大型动物实验验证其规模化制备的稳定性，在患者来源异种移植（PDX）模型中系统评估其治疗效能，并建立规范的长期安全性评价体系。

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